革蘭氏染色法不僅用來觀察細菌的形態，而且它還是細菌鑒定的重要方法，它可將全部細菌區分別革蘭氏陽性菌和陰性菌兩大類。革蘭氏染色法的步驟為：涂片→固定→結晶紫色染色→水洗→碘液媒染→水洗→酒精脫色→番紅復染→水洗→干燥→觀察。

　　涂片 與單染色法相同。

　　固定 與單染色法相同。

　　結晶紫染色 染色1分鐘，然后水洗并用吸水紙吸干。

　　碘液媒染 染色1分鐘，然后水洗并吸干。

　　酒精脫色 用95%酒精脫色，直到酒精不出現紫色時即停止（大約半分鐘），然后立即水洗，并吸干。

　　番紅復染 染色3分鐘左右，然后水洗并吸干。

　　鏡檢 在顯微鏡油鏡頭下觀察，菌體顯藍紫色的為革蘭氏陽性菌；菌體顯紅色的為革蘭氏陰性菌。