一、非特異性染色的主要因素

組織的非特異性染色的機理很復雜，其產生的原因主要可分為以下幾點：
（1）一部分熒光素未與蛋白質結合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。
（2）抗體以外的血清蛋白與熒光素結合形成熒光素脲蛋白，可與組織成分結合。
（3）除去檢查的抗原以外，組織中還可能存在類屬抗原（如Forssman氏抗原），可與組織中特異性抗原以外之之相應抗體結合。
（4）從組織中難于提純抗原性物質，所以制備的免疫血清中往往混雜一些抗其他組織成分的抗體，以致容易混淆。
（5）抗體分子上標記的熒光素分子太多，這種過量標記的抗體分子帶過多的陰離子，可吸附于正常組織上而呈現非特異性染色。
（6）熒光素不純，標本固定不當等。

二、消除非特異性染色的方法
消除熒光抗體非特異性染色的方法應根據產生的原因采取適當的方法，常用的方法有以下幾種：
（一）動物臟器粉末吸收法
常用肝粉（豬、大白鼠或小白鼠），其次是骨髓粉、鼠腦粉和雞胚粉等。每毫升熒光抗體中加入肝粉50～100mg,在離心管中充分混勻，在室溫中振動2h，4℃中過夜，再攪拌10min，高速離心（3000～15000r/min）30min，1～2次后，即可使用其上清液。吸收一般應在臨用前進行，吸收后之熒光抗體保存冰箱中勿超過2周。染色應作吸收前后之比較，吸收時可先用緩沖鹽水將組織干粉浸濕，離心（3000～15000r/min）30min，除去上清液，再加入熒光抗體進行吸收，以免消耗過多的抗體。
肝粉或新鮮細胞吸收是一種非特異性的消除方法，對熒光抗體的熒光色素和蛋白都有吸附作用。如檢查組織中的病毒抗原時，也可用相同的組織干粉或勻漿沉淀物吸收之。
用臟器肝粉吸收對熒光抗體損失較多，如果根據Hiramotos氏等的方法將組織的20%生理鹽水勻漿液，用生理鹽水洗2～3次，12000r/min
10min離心沉淀，用其沉淀物吸收其熒光抗體即能*達到目的，京極方久氏認為這樣吸收對熒光抗體幾乎沒有損失，他們常用此法，效果甚佳，吸收后放置一周左右，用時有必要再吸收一次。
【肝粉的制法】
（1）將若干只小白鼠或大白鼠放血殺死，取出肝臟，用生理鹽水洗2～3次，除去血液，剝掉表面的結締組織的脂肪。
（2）剪碎，用生理鹽水反復洗滌至無血色止，然后再加生理鹽水少許，用組織搗碎機或勻漿器作成勻漿。
（3）將肝勻漿裝入離心管內（1/3左右），交換地用2～3倍量生理鹽水和丙酮反復洗滌各三次，至上清無血色止，每次完畢先用2000r/min離心沉淀15 min后，再除去上清液。
（4）zui后用丙酮洗滌肝漿，再用布氏漏斗過濾，或離心沉淀，將沉淀物平鋪在潔凈的玻璃板上，37℃烤干（過夜）。
（5）在乳缽中充分研磨，用120目銅篩篩選過后，分裝，密封，低溫干燥保存。 （二）透析法
熒光素如FITC分子可以通過半透膜，而蛋白質大分子不能透過，可將未與蛋白結合的熒光素透析除去。
（1）將標記完畢的熒光蛋白液裝入一透析袋或玻璃紙袋內，液面稍留空隙，緊扎。
（2）浸入0.02mol/pH
7.1～7.4的PBS中（懸于大于標記物體積約50～100倍的PBS內），在4℃中透析，每日更換3～4次PBS，約5～7天，透析液中無熒即可（在熒光光源照射下）。
（三）葡聚糖凝膠G-50柱層析法
除游離熒光素可用2×46cm柱層析法，詳細方法參閱第二章。加入熒光抗體15～18ml（按床體積的5%～10%加樣），使其緩慢滲入柱內，待即將全部入柱時，加入PBS少許，關閉下口，停留30～40min ，使游離熒光充分進入細篩孔中，然后再接通洗脫瓶開始滴入洗脫液。加入洗脫液一定量后，熒光抗體即向下移行，逐漸與存留于上端的游離熒光素之間拉開明顯的界線，隨著大量洗脫液的不斷加入，二者分離距離越來越大，熒光抗體zui先流出，分前、中、后三部分收集，測F/P比值，合格者合并，濃縮，分裝。洗脫液用20%磺基水楊酸測定蛋白（發生沉淀反應），繼續洗脫，游離熒光素則相繼被洗脫下來，至洗脫液中無蛋白和熒光素后，此層析柱即可再用。
若用以除去熒光抗體中的游離熒光素和硫酸銨等鹽類，可先在過柱前透析一夜，否則，NH 4+太濃，在蛋白未*洗脫時即出現NH4+，因而影響提純與回收蛋白，一般待洗脫液出現蛋白時，即進行收集，之后出現SO4++（用1%BaCl2檢查發生白色沉淀）。zui后是NH 4+，（用納氏試劑檢查呈黃棕色沉淀），待洗脫液無SO4++及NH 4+后可再用。
如僅用小量熒光抗體，可用1×20cm的柱層析柱，取2g Sephadex G-50裝柱，即可過濾2～3.5ml熒光抗體。
（四）DEAE纖維素柱層析法
標記過多或過少熒光素的抗體分子可用DEAE-纖維素柱層析法除去。方法如下： DEAE-纖維素柱的裝柱，洗脫、再生方法等與提純IgG方法相同。裝柱所需DEAE-纖維素量以干重每克交換20～50mg標記蛋白量為宜
。常用梯度洗脫法如下：
（1）層析柱用0.01mol/L、pH7.2PB平衡，標記物上柱后，先用0.01mol/L、pH7.2PB洗脫，洗出無色或淡綠色液體，洗脫液量（根據床體積大小每梯度乘3），然后依下列各種離子強度洗脫液，
分別洗脫和收集：
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.05mol/L NaCl）……洗脫部分1。
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.01mol/L NaCl）……洗脫部分2。
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.02mol/L NaCl）……洗脫部分3。
將此三部分收集液（每管5ml）分別測定其F/P比值，0.05mol/L NaCl pH7.2PB洗脫液280nm光密度高峰管合并，濃縮保存備用。因這部分非特異性染色熒光zui少，是比較好的熒光抗體。其他兩部分可以廢棄。

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