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一氧化氮（NO）檢測試劑盒說明書

1. 測定意義和原理

一氧化氮NO（即血管內(nèi)皮舒張因子），在生物體內(nèi)作為一種反應(yīng)性*的自由基，兼有信使和神經(jīng)遞質(zhì)作用，同時又是一種效應(yīng)分子，在體內(nèi)具有廣泛的生理作用，如松弛血管平滑肌，抑制血小板聚集，調(diào)節(jié)腦血流，介導(dǎo)細(xì)胞毒效應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)，參與學(xué)習(xí)和記憶、動脈粥樣硬化等作用。NO產(chǎn)生異常于某些疾病的發(fā)生有著密切關(guān)系。

NO本身半衰期極短，血液中的NO主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、血小板、巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生以硝酸鹽及亞硝酸鹽的形式存在，通過其濃度可以間接測得NO的濃度。

NO遇氧及水生成硝酸鹽及亞硝酸鹽，后二者遇硝酸鹽顯色劑可生成淡紅色偶氮化合物，通過檢測可得知NO 濃度。

2. 試劑組成及配置（96T）

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顯色劑的配置： 試劑三：試劑四：試劑五=2.5:1:1，現(xiàn)用現(xiàn)配，配好的顯色劑放冰箱保存，顏色變得很深后不可使用

20umol/L亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液配置：取2mmol/L亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液0.1ml加雙蒸水定容到10ml即為20umol/L 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

3. 操作過程

A. 前處理

血清（血漿）：取血清（血漿）原液100ul加試劑一200ul，混勻，加試劑二100ul，漩渦充分混勻后靜置10分鐘，3500-4000轉(zhuǎn)/分鐘，離心15分鐘，取上清160ul操作。

組織：取10%勻漿上清300ul加試劑一200ul，混勻，加試劑二100ul，漩渦充分混勻后靜置10分鐘，3500-4000轉(zhuǎn)/分鐘，離心15分鐘，取上清160ul操作。

B. 操作表：

  混勻，靜置15分鐘，波長550nm，用酶標(biāo)儀測定各孔吸光度OD值。

4. 計算公式 略

5. 計算舉例

    A. 取血清0.1ml，按照測定要求所示，進(jìn)行操作，所得空白孔吸光度為0.0406，標(biāo)準(zhǔn)孔為0.4117，測定孔吸光度0.0795，計算如下：

NO含量=  （0.0795-0.0406）÷(0.4117-0.0406)X20X4=8.38 umol/L

B. 取10%組織勻漿上清,按照測定所示要求,進(jìn)行操作,所得空白孔吸光度為0.0406,標(biāo)準(zhǔn)孔吸光度為0.4117,測定孔吸光度0.0543,同時測得組織勻漿上清中總蛋白濃度為11.6574gprot/L,計算如下:

NO含量= (0.0543-0.0406) ÷(0.4117-0.0406)x20x2÷11.6574=0.127umol/gprot

6. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:  用雙蒸水將2mmol/L亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行1:39, 1:79, 1:99, 1:159, 1:319, 1:639稀釋.即亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液濃度依次為: 50umol/L, 25umol/L, 20umol/L, 12.5umol/L, 6.25umol/L,3.125umol/L

7. 注意事項:

A. 嚴(yán)格按照操作規(guī)程

B. 離心后的上層液一定要澄清,若有渾濁要再次離心

C. 溶血及渾濁血清對測定結(jié)果有影響

D. 培養(yǎng)液的測定參照血清(血漿)的操作及計算

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