ELISA實(shí)驗(yàn)中酶制劑及其底物的重要性！

酶制劑及其底物

凡無毒性又能呈現(xiàn)有色化學(xué)反應(yīng)的酶，原則上均可作為標(biāo)記用。但作為標(biāo)記抗體用的酶應(yīng)滿足下列要求：

(1)來源方便，易于純化;

(2)比活性高，性質(zhì)穩(wěn)定;

(3)酶活性和量能

用簡(jiǎn)單方法測(cè)定。目前在免疫酶技術(shù)中常用的酶為辣根過氧化物酶(HRP)和鹼性磷酸酶(AP)，其次還有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和蘋果酸脫氫酶等。

由于辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，穩(wěn)定，分子量小，純酶容易制備，所以zui常用。HRP廣泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結(jié)合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多個(gè)同功酶組成，分子量為40,000,等電點(diǎn)為PH3～9,酶催化的zui適PH因供氫體不同而稍有差異，但多在PH5左右。酶溶于水和58%以下飽和度硫酸銨溶液。HRP的輔基和酶蛋白zui大吸收光譜分別為403nm和275nm，一般以O(shè)D403nm /OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的純度。高純度的酶RZ值應(yīng)在3.0左右(zui高可達(dá)3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，純度并不表示酶活性，如當(dāng)酶變性后，RZ值仍可不變。

HRP的催化反應(yīng)需要底物過氧化氫(H2O2)和供氫體(DH2)。供氫體多為無色的還原型染料，通過反應(yīng)可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反應(yīng)的過程如下:

HRP2 ~2 y( w9 E+ M

DH2+H2O2────→D+2H2O

供氫體的種類很多，形成的產(chǎn)物特點(diǎn)不一。如DAB(3.3-二氨基聯(lián)苯胺)的反應(yīng)產(chǎn)物為不溶性沉淀物，并有電子密度，故適宜于做免疫酶染色或電鏡觀察。S(5-氨基水楊酸)早期曾用于ELISA，但其溶解度不夠大，且空白孔不易控制到無色，現(xiàn)已很少應(yīng)用。OT(鄰聯(lián)甲苯胺)的特點(diǎn)是能產(chǎn)生鮮艷的藍(lán)綠色產(chǎn)物且靈敏度較高，但反應(yīng)中受溫度影響較大，而且由于產(chǎn)物不穩(wěn)定，需要在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。目前用得較廣泛和較滿意的供氫體是：OPD(鄰苯二胺)和TMB(四甲基聯(lián)苯胺)。前者形成的產(chǎn)物為深桔黃色或棕色，后者產(chǎn)物為藍(lán)綠色，二者的可溶性均好，在避光處顏色穩(wěn)定，空白可近于無色，靈敏度上據(jù)報(bào)道后者比前者可高4倍以上。另外，還有一種供氫體稱ABTS[2, 2-邊氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)]，其反應(yīng)產(chǎn)物呈藍(lán)綠色，且靈敏度和穩(wěn)定性均好。尤其是在致癌的潛在可能性方面，ABTS與TMB皆是值得被優(yōu)選的供氫體。

由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制劑，因此酶促反應(yīng)中使用的H2O2不能過量。應(yīng)控制在經(jīng)較短時(shí)間反應(yīng)后呈色即達(dá)高峰(說明H2O2已消耗殆盡)。這樣即使再延長(zhǎng)時(shí)間也不會(huì)增加反應(yīng)產(chǎn)物的顏色。

酶與抗體交聯(lián)的方法有許多種,根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)不同可采用不同的方法。對(duì)于制備HRP結(jié)合物，可用戊二醛二步法和過dian酸鈉法。常用過dian酸鹽氧化法，這種方法法只適用于含糖量較高的酶。過dian酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基，醛基與抗體分子上的氨基形成Schiff堿而結(jié)合。后者可進(jìn)一步用NaBH4(或乙醇胺)還原生成穩(wěn)定的酶標(biāo)記抗體。

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