血清內毒素(LPS)檢測試劑試劑盒試劑原理

【用途】顯色基質鱟試劑 ( Chromogenic End-point Tachypleus Amebocyte Lysate , CE TAL )用于體外細菌內毒素的定量檢測，禁止以任何途徑進入機體。

【原理】鱟試劑為鱟科動物東方鱟的血液變形細胞溶解物的冷凍干燥品,鱟試劑中 含有Ｃ因子、Ｂ因子、凝固酶原、凝固蛋白原等。在適宜的條件下（溫 度，pH 值及無干擾物質），細菌內毒素激活 C  因子，引起一系列酶促反應， 激活凝固酶原形成凝固酶，凝固酶分解人工合成的顯色基質，使其分解為 多肽和黃色的對硝基苯胺（pNA，λmax = 405nm） 。在一定時間內，pNA 的 生成量與細菌內毒素濃度成正相關，據此，可以定量供試品的內毒素濃度。 同時，對硝基苯胺（pNA）也可用偶氮化試劑染成玫瑰紅色（λmax = 545nm）， 避免了供試品本身的顏色對 405nm 處吸收峰的干擾。

1 .材料和設備

1.1  試劑

鱟試劑、細菌內毒素工作品、顯色基質、偶氮化試劑 1  、偶氮化試劑 2  、偶氮化試 劑 3、HC l (  反應終止劑)  、細菌內毒素檢查用水。

1.2 器材

無熱原試管、無熱原吸頭。

旋渦混合儀、移液器、多道移液器、封口膜、試管架。 恒溫水浴箱（37±1℃）、分光光度計。

注意：接觸試劑及供試品的所有器皿必須是無熱原的(我公司提供無熱原耗材)。

玻璃器皿可經 250℃干烤至少 60 分鐘去除熱原。 2.  供試品的貯存與預處理

備注：   若供試品為血液類，請參照我廠配套血液相關處理試劑使用說明書。
2.1 供試品的 pH 值應在 6 - 8 之間，若超出此范圍，需用無熱原緩沖液、0.1N 氫氧化鈉 或 0.1N 鹽酸調節。

2.2  若供試品中可能存在鱟實驗的干擾物質，處理參見【供試品的干擾試驗】。

2.3 若供試品中可能含有β－葡聚糖（β－葡聚糖會產生 G 因子旁路反應，干擾內毒素 檢測），需選用特異性鱟試劑（我公司提供）。

2.4   若供試品為一些抗菌素如頭孢類抗菌素和磺胺制劑會對偶氮染色劑產生偶聯反應 而干擾偶氮化顯色，需要選用不含偶氮化試劑的試劑盒（我公司提供）。

2.5 若供試品的本底吸光度值大于 0.5,必須對供試品進行稀釋后再檢測。

2.6   若供試品顏色較深(例如溶血)，或在酸性條件下顏色加深(例如一些組織培養介質), 必須設置供試品空白管以扣除供試品自身的顏色本底。 供試品空白管不加入鱟試劑，以等體積鱟試劑的溶劑(該處為細菌內毒素檢查用水) 代替。其余操作同供試品管。

3.實驗操作

3.1 細菌內毒素標準溶液配制

標準曲線所采用的內毒素濃度可以為 0.01, 0.025, 0.05, 0.1 EU/ml 或 0.1, 0.25, 0.5,1.0

EU/ml。稀釋方法如下（以 0.1, 0.25, 0.5, 1.0 EU/ml 為例）：取細菌內毒素工作品 1 支，按細菌內毒素工作品使用說明書稀釋為 10EU/ml 的內毒素溶液，再稀釋為 1.0EU/ml 的內毒素溶液，以 1.0EU/ml 的內毒素溶液為母液按下表稀釋成 0.1,0.25,

0.5, 1.0 EU/ml 的濃度梯度。配制好的內毒素標準溶液應在 4 小時內用完。

3.2 陰性對照為細菌內毒素檢查用水。

鱟試劑：按標示量加細菌內毒素檢查用水于鱟試劑中，輕輕振搖使鱟試劑*溶解, 注意不要用旋渦混勻儀激烈振搖。溶解的鱟試劑應在 10 分鐘內用完。 顯色基質：按標示量加細菌內毒素檢查用水于顯色基質中，輕輕振搖使顯色基質 *溶解。顯色基質溶液可在無污染的條件下于 4  ºC 貯存 8 小時以內。 偶氮化試劑 1：按標示量加反應終止劑鹽酸于偶氮化試劑 1 中，

偶氮化試劑 2：按標示量加細菌內毒素檢查用水于偶氮化試劑 2 中， 偶氮化試劑 3：按標示量加細菌內毒素檢查用水于偶氮化試劑 3 中， 偶氮化試劑溶液可于 4ºC 貯存 1 周。

3.4 實驗操作取無熱原試管，加入 100μl 細菌內毒素檢查用水、內毒素標準溶液，或供試品。

再加入 100μl 鱟試劑溶液，混勻，37ºC 溫育 T1 分鐘。 溫育結束，加入 100μl 顯色基質溶液，混勻，37ºC 溫育 T2 分鐘。 溫育結束，加入 500μl 偶氮化試劑 1 溶液，混勻，加入 500μl 偶氮化試劑 2 溶液，混勻加入 500μl 偶氮化試劑 3 溶液，混勻，靜置 5 分鐘，于 545nm 波長處讀取吸光度 值。(見表２)

【供試品的干擾試驗】

供試品的干擾試驗詳見《中華人民共和國藥典》2005  版中《細菌內毒素檢查法》的 “光度測定法干擾試驗”。當鱟試劑、供試品的來源、配方、生物試劑工藝改變或試驗 環境中發生了任何有可能影響試驗結果的變化時，須進行干擾試驗,步驟如下:

1  選擇標準曲線中點或一個靠近中點的內毒素濃度（設為 λm），作為供試品干擾 試驗中添加的內毒素濃度，配制含 λm 內毒素的供試品陽性對照，測量出該溶液 的內毒素濃度,稱為 Cs；

2  測量出未添加外源內毒素的供試品溶液內毒素濃度,稱為 Ct；

3  計算該試驗條件下的回收率 R＝（Cs–Ct）/λm×100%

4  當 R 在 50%～200%之間，則認為在此試驗條件下供試品溶液不存在干擾作用。

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