細(xì)胞膜蛋白提取試劑盒實(shí)驗(yàn)操作！
 

　　產(chǎn)品名稱：細(xì)胞膜蛋白提取試劑盒
 

　　規(guī)格：50T
 

　　儲(chǔ)存：2~8℃保存
 

　　細(xì)胞膜蛋白提取試劑盒能夠從哺乳動(dòng)物新鮮或凍存的組織塊、貼壁或懸浮細(xì)胞中制備細(xì)胞膜與胞內(nèi)質(zhì)膜組分。其*的試劑成分與優(yōu)化的制備方案使胞膜制備過程簡(jiǎn)單易行，無需特殊設(shè)備和超速離心，可在1小時(shí)內(nèi)完成。應(yīng)用本試劑盒制備的胞膜是細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及質(zhì)膜的混合物。制備得到的產(chǎn)物純度可勝任后續(xù)的免疫沉淀、蛋白印跡、2-D gel、酶活性檢測(cè)和受體分析等實(shí)驗(yàn)。
 

　　實(shí)驗(yàn)步驟：
 

　　收集細(xì)胞：(在每一次制備過程中，使用等量的細(xì)胞數(shù)將明顯提高后續(xù)檢測(cè)結(jié)果的一致性，因此建議在制備前對(duì)細(xì)胞準(zhǔn)確計(jì)數(shù))
 

　　貼壁細(xì)胞：用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞平皿，用胰蛋白酶消化細(xì)胞。800g離心5-10分鐘，棄上清，用PBS緩沖液重懸洗滌細(xì)胞并再次離心收集細(xì)胞。
 

　　懸浮細(xì)胞：800g離心5-10分鐘，棄上清。用PBS緩沖液重懸洗滌細(xì)胞并再次離心收集細(xì)胞。
 

　　以下制備過程要在4 oC或冰水浴中進(jìn)行
 

　　組織細(xì)胞勻漿裂解
 

　　向每1x107個(gè)細(xì)胞或每100µl(細(xì)胞離心后的體積)細(xì)胞沉淀中加入500µlCER試劑，震蕩重懸，冰浴2分鐘。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到冰預(yù)冷的玻璃勻漿器內(nèi)，在冰水浴中上下手動(dòng)勻漿20-30次。
 

　　注意：此破碎細(xì)胞步驟為關(guān)鍵環(huán)節(jié)。要使用1-3ml小容積玻璃勻漿器，須選用間隙嚴(yán)密的研杵，其特征是將研杵插入勻漿器套管后，可提起研杵而套管不會(huì)脫落。有效研磨是上下推拉而不是旋轉(zhuǎn)。破碎效果與細(xì)胞類型有關(guān)，可在相差顯微鏡下檢查，未裂解細(xì)胞應(yīng)小于5%。
 

　　組織塊勻漿裂解：
 

　　取250mg哺乳動(dòng)物新鮮或-80 oC凍存組織塊放入冰預(yù)冷的玻璃勻漿器內(nèi)，加入500µlCER試劑。用研杵搗碎組織塊，上下手動(dòng)勻漿20次，冰浴10分鐘，然后上下手動(dòng)勻漿7次。
 

　　注意：與培養(yǎng)細(xì)胞特別是貼壁細(xì)胞相比，組織塊中的細(xì)胞在勻漿時(shí)較易破碎，因而并非必須選擇間隙嚴(yán)密的研杵。如果研杵與套管過于嚴(yán)密，會(huì)使組織勻漿困難，可選用研杵與套管稍松的勻漿器，破碎效果與組織細(xì)胞類型有關(guān)，可在相差顯微鏡下檢查，未裂解細(xì)胞應(yīng)少于5%。
 

　　粗提物制備：
 

　　取約500µl裂解物，轉(zhuǎn)移到新的離心管中，800g ,4oC離心5分鐘。上清為胞膜-胞漿混合物。
 

　　胞膜胞漿制備：
 

　　1)將步驟三獲得的上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，估計(jì)上清的體積；
 

　　2)加入上清液1/10體積的MER與上清液混合，冰浴5分鐘；
 

　　3)14,000rpm，4oC離心30分鐘；
 

　　4)沉淀為胞膜組分，含有細(xì)胞膜和亞細(xì)胞器碎片，可短暫離心除盡液體，用50-100µl Suspension Buffer重懸備用或用RIPA裂解胞膜；