ChIP原理及應用

ChIP實驗研究轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控因子結(jié)合的DNA和組蛋白結(jié)合的NDA操作上最大的區(qū)別是什么？

ChIP實驗中由于組蛋白在染色質(zhì)中表達相對較高，表達也較穩(wěn)定，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子表達水平很低，往往是瞬時表達。所以組蛋白研究起來更為容易，一般需要105-106個細胞即可完成一個ChIP反應。研究起始樣本量（細胞，組織）要是組蛋白的10倍，一般每個反應至少需要107個細胞。另外有些轉(zhuǎn)錄因子比較大，往往結(jié)合多個核小體，因此在染色質(zhì)斷裂的時候，不太適合使用酶法的處理方式，建議使用超聲斷裂染色質(zhì)的方法。因為酶法是化學處理，消化的位點往往比較均一，多是在核小體的連接處，酶消化有可能將核小體斷裂的同時打斷轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合。

ChIP實驗中使用超聲方法斷裂染色質(zhì)溫度不易控制，可能會使蛋白變性，影響ChIP結(jié)果，有沒有較好的優(yōu)化方案？

ChIP實驗中超聲的優(yōu)化一般從如下幾個方面考慮：

1 不建議重復已發(fā)表的剪切方案而不進行優(yōu)化。當儀器不同于文獻中所使用的儀器時，尤其如此。

2 目前有各種超聲破碎儀器，水浴和基于探頭的。在使用基于探頭的超聲破碎儀時，選擇一個適用于您的樣品體積的探頭。

3 在任何情況下，剪切參數(shù)都應當根據(jù)您的樣品體積、細胞密度和細胞類型而優(yōu)化。

4 優(yōu)化應當包括功率設置（超聲時間 vs. 間隙時間/休息時間）以及獲得長度為200 – 1000 bp的DNA片段所需的剪切循環(huán)數(shù)，每個優(yōu)化實驗只優(yōu)化一種參數(shù)；

5 注意時間和功率設置。過度破碎和太高功率設置會損害在免疫沉淀步驟中的表位。降低ChIP信號。

6 始終保持裂解液冰冷，間斷超聲，而不是連續(xù)，因為超聲處理產(chǎn)生熱量會使染色質(zhì)變性。

7 在超聲破碎過程中避免氣泡。泡沫會導致蛋白質(zhì)的表面變性，可能使染色質(zhì)損失在氣泡中。為了避免這種情況，一開始設為較低功率，再逐步提高。

8 在優(yōu)化條件時，每個超聲破碎循環(huán)后通過瓊脂糖凝膠電泳分析DNA片段的長度。剪切不足所產(chǎn)生大的不溶蛋白質(zhì):DNA:RNA復合物可能堵塞瓊脂糖凝膠的孔，并延緩電泳過程。通過消化蛋白質(zhì)、逆轉(zhuǎn)交聯(lián)、酚:氯仿提取和沉淀來純化DNA。

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