乳鐵蛋白的分離和檢測方法

乳鐵蛋白(lactoferrin，LF)是乳汁中一種重要的非血紅素鐵結(jié)合糖蛋白，中性粒細胞顆粒中具有殺菌活性的單體糖蛋白。其分子量為80 kDa，主要由上皮細胞表達和分泌。

1939年Sorensen等人在分離乳清蛋白時得到一種紅色蛋白，Polis等人在分離Lp時也得到部分純化的紅色蛋白，但至1959年Groves用色譜得到純的紅色物質(zhì)后，才確認這種紅色物質(zhì)是一種與鐵結(jié)合的糖蛋白，稱之為乳鐵蛋白。

乳鐵蛋白不僅參與鐵的轉(zhuǎn)運，而且具有廣譜抗菌、抗氧化、抗癌、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等強大生物功能，被認為是一種新型抗菌、抗癌藥物和開發(fā)潛力的食品和飼料添加劑。

乳鐵蛋白是由科學家MONTREUIJ和JOHANSONB于1960年在母乳中發(fā)現(xiàn)的，隨后BAGGIN等科學家在一些生物體的體液和各種細胞中發(fā)現(xiàn)了這種蛋白質(zhì)并開始了大量研究。

研究表明，乳鐵蛋白是動物初乳中的天然蛋白質(zhì)，是一種多功能蛋白質(zhì)。研究表明，乳鐵蛋白肽具有廣泛的生物學活性，包括廣譜抗菌作用、消炎、抑制腫瘤細胞生長及調(diào)節(jié)機體免疫反應等，被認為是一種新型抗菌、抗癌藥物和開發(fā)潛力的食品、化妝品添加劑，市場前景廣闊。

2012年3月30日，中國《食品安全國家標準——食品營養(yǎng)強化劑使用標準》將乳鐵蛋白列入GB14880-2012，認定為食品營養(yǎng)強化劑，乳鐵蛋白也是母乳中含有的*的成份，可以抑制病毒和有害菌，有提高嬰兒免疫力的作用。

目前報道的Lf分離方法很多，主要有色譜法（吸附色譜法、離子交換色譜法、親和色譜法、固定化單系抗體法等）和超濾法。

色譜法的優(yōu)點是分離效果好、純度高，抗體被固定化可重復使用，其缺點是柱的制備工藝復雜，抗體成本昂貴，難以工業(yè)化生物試劑。超濾法操作簡便，費用相對較低，易于形成工業(yè)化規(guī)模，其缺點是乳鐵蛋白純度較低，膜需經(jīng)常清洗。

超濾法是生物試劑食品用乳鐵蛋白實現(xiàn)工業(yè)化潛力的方法之一 ，具有*的營養(yǎng)價值。

乳鐵蛋白及其蛋白降解產(chǎn)物—乳鐵蛋白肽具有廣泛的生物學活性，包括廣譜抗菌作用、消炎、抑制腫瘤細胞生長及調(diào)節(jié)機體免疫反應等，被認為是一種新型抗菌、抗癌藥物和開發(fā)潛力的食品、化妝品添加劑，如美國食品藥品管理局早巳允許乳鐵蛋白作為用于運動、功能性食品。

乳鐵蛋白的分離和檢測方法

乳鐵蛋白屬于先天免疫系統(tǒng)的成分物質(zhì)。除了能夠結(jié)合和運輸鐵離子的主要功能外，乳鐵蛋白還具有抗菌，抗病毒，抗寄生蟲，催化，防癌抗癌，抗過敏和輻射防護的功能和屬性。

母乳與配方奶粉相比，母乳喂養(yǎng)的嬰幼兒能更有效的利用母乳中的營養(yǎng)物質(zhì)，也不易患各種感染性疾病，保持正常生長和發(fā)育，主要是因為母乳中含有乳鐵蛋白、免疫球蛋白和溶菌酶等多種活性蛋白，能促進營養(yǎng)成分的消化、吸收，并保護機體免受微生物感染。

其中乳鐵蛋白還通過促進胃腸道，特別是黏膜免疫系統(tǒng)的正常發(fā)育，在機體免疫防疫系統(tǒng)方面起著重要作用，奶粉中添加了乳鐵蛋白更接近母乳，從而強化這些免疫因子能增加其免疫功能。

原理：混有乳鐵蛋白(LF) 抗原的瓊脂糖傾入平板，凝凍后打一些小孔，接入LF樣品。隨著抗原呈放射形擴散， 在以小孔為中心的環(huán)狀區(qū)域形成抗原?抗體反應沉淀帶， 沉淀帶在RID染色液的作用下被染色，環(huán)的直徑與抗體(LF)的濃度成正比。通過標準曲線，可以測出樣品中的(LF) 濃度。

操作步驟：將預涂過的玻璃板置于水平桌面上，在瓊脂糖緩沖液中 加入150ml(抗血清，仔細混合后將溶液倒在玻璃板中心。表面張力可以阻止溶液溢出，必要時用試管上緣幫助溶液分散以確保溶液均勻分散到玻璃板的各邊。

將凝膠在室溫下固化15min，然 后置于恒濕器中在冰箱中保存1h 。將打孔器與抽真空設備連接，并利用帶模板的隔板架在凝膠上 打16個小孔。

用注射器小心地將12.5ml樣品注入玻璃板中，將凝膠置于恒濕器中，室溫下在水平桌面上放置48h后清洗凝膠。選擇正確角度，2次測量環(huán)的直徑，以此來測定LF濃度。

結(jié)果計算：每毫升LF的濃度(×10 ) =
式中：A為LF標準溶液(mg/mL) ；
W為質(zhì)量(mg) 。

乳鐵蛋白的分離和檢測方法

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