信帆生物為您解答Western blot實驗當中的問題！

Western blot實驗中常常出現各種問題？信帆生物為您解答以下幾點主要困惑：

1、蛋白質電泳時配制的凝膠為什么凝固前是有毒的，凝固后就無毒性了呢？

因為發發生了聚合反應，丙烯酰胺是單體，甲叉雙丙烯酰胺是交聯劑，在水溶液中，單體和交聯劑通過自由基印發的聚合反應形成凝膠。

2、內參怎么做？是在同一張膜上還是另外再跑一張膜來做？是不是與蛋白的分子量大小有關系呢？

可以用同一張膜，轉膜后先用目的蛋白的抗體做雜交，將抗體洗掉，再用內參抗體重新雜交，結果顯示信號一致，就可以認為上樣量一致。

3、WB電泳出現笑臉和哭臉的情況？

出現笑臉是因為灌膠的時候冷卻不均勻，中間部分沒冷卻好，導致凝膠中的分子有不同的遷移率所致。

4、做western，背景很深，目的蛋白恨模糊，actin很清楚，什么原因？

背景比較重，可能是二抗濃度高了或者二抗洗得不*；如果是單純的目的條帶弱，有可能蛋白表達量本身就低，或者一抗濃度不夠。

5、麗春紅染膜能看到清晰的條帶，但是發光的片子上去沒有條帶？

麗春紅染膜能看到條帶，只能說明轉膜是沒有問題的，所以沒有條帶應該是磚模后的步驟有問題。可排查后邊的步驟。

6、轉膜的時候蛋白marker是不是可轉可不轉，不轉對后邊實驗是否有很大的影響？

這種方法在樣本多的情況下很容易弄混，這么做主要是后期孵抗體的時候可以將膜封閉到很小的空間里進行孵育，可以節省抗體。

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