Annexin V-FITCPI凋亡檢測試劑盒使用原理

磷脂酰絲氨酸（PS）是?種帶負電荷的磷脂，正常細胞中，PS只分布在細胞膜脂質雙層的內側，?在細胞凋亡早期，細胞膜PS由脂膜內側翻向細胞膜外側，使PS暴露在細胞膜外表?。Annexin V是?種分?量為35~36kD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋?，與磷脂酰絲氨酸有?度親和?，故可通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此Annexin V被*為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之?。

操作說明

1. 細胞樣品的準備：

a) 懸浮細胞：

1）收集細胞?離?管中1000-2000rpm離心5min，小心去除上清。

2）用1ml 4℃預冷PBS輕輕重懸細胞并計數，1000-2000rpm離心5min，小心吸除上清。

3）再加?1ml 4℃預冷的PBS重懸細胞，1000-2000rpm離心5min，小心吸除上清。

b) 貼壁細胞：

1）吸出細胞培養液至離?管中，PBS洗滌貼壁細胞?次，加?適量不含EDTA的胰酶細胞消化液消化細胞。

2）室溫孵育?輕輕吹打可以使貼壁細胞吹打下來時，吸除胰酶細胞消化液。需避免胰酶的過度消化。

3）加?以上步驟中收集的細胞培養液，稍混勻，轉移到離?管內，1000-2000rpm離?5min，??吸除上清。

注：加?的細胞培養液一方面可以收集已經懸浮的發?凋亡或壞死的細胞，另一方面細胞培養液中的?清可以有效抑制或中和殘留的胰酶；殘留的胰酶會消化并降解后續加?的 Annexin V-FITC 導致染?失敗。

4）?1ml 4℃預冷PBS輕輕重懸細胞并計數，1000-2000rpm離心5min，小心吸除上清。

5）再加?1ml 4℃預冷的PBS重懸細胞，1000-2000rpm離心5min，小心吸除上清。

本試劑盒將Annexin V進?綠?熒光（FITC）標記，以標記了的Annexin V作為探針，利?熒光顯微鏡或流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發?。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是?種核酸染料，它不能透過正常細胞或早期凋亡細胞的完整的細胞膜，但對凋亡中晚期的細胞和壞死細胞，PI能夠透過細胞膜?使細胞核染紅。因此采?Annexin V與PI雙染的?法，就可以將處于不同凋亡時期的細胞區分開來。