Caspase-1酶活性測定試劑盒操作說明

描述：

Caspase是參與細胞凋亡過程的蛋白酶家族，包含10多個成員。其中Caspase-1是唯-一可剪切IL-1b和IL-18前體產生活性細胞因子的caspase。Caspase-11剪切45kD的caspase-1前體蛋白產生20kD和10kD片斷，這兩個片斷可以形成異源二聚體，并進一步形成四聚體。此四聚體具有蛋白酶活性。Caspase-1通過剪切Bcl-XL調節細胞凋亡，并通過對細胞因子前體的剪切來調控相關細胞因子介導的免疫炎性反應。測定原理基于Caspase-1特異水解多肽底物Tyr-Val-Ala-Asp-p-nitroanilide (YVAD-pNA)，釋放的游離硝基苯胺pNA在405 nm有最大吸光度。采用可見光光度比色法測定pNA而得到Caspase活性。適用于檢測哺乳動物組織、細胞Caspase-1活性。

所需儀器：

可見光分光光度計配100μl比色杯，或酶標儀。最佳波長405 nm，也可測OD400~450 nm但靈敏度略降。

組織細胞準備：

Caspase活性測定值低，最常見原因是未發生凋亡或細胞量太少，其次是觀測時間點不恰當。誘導凋亡時，并非劑量越大時間越長Caspase活性就越高。可設置不同劑量和時間點如0、2、4、8、16、24小時，以檢測最佳的觀察點。通常2×107細胞或2mg組織裂解于1ml可產生1~3mg/ml蛋白。初次測定時，單個測定反應可加~200μg蛋白物對應于2×106細胞或2個孔的6孔板細胞。最少，單個測定反應需加20μg蛋白對應于2×105個細胞或2個孔的12孔板細胞。勿用絲氨-酸蛋白酶抑制劑如E-64和leupeptin以免抑制Caspase活性。

1. (1)細胞裂解：1000g 5分鐘收集細胞，吸盡上清。每2~10×106細胞加50~100µl裂解液震蕩裂解，冰浴10分鐘，再次震蕩。(2)組織裂解：3~10mg組織加100 µl裂解液放入小型玻璃勻漿器，上下勻漿30次。轉移勻漿液于離心管。

2. 4 oC 12,000g 10分鐘，取上清測定，或-70 oC保存。

3. 蛋白定量：用Bradford法測定蛋白濃度。裂解液含還原劑不宜采用BCA法。應使蛋白濃度達到1-3 mg/ml，相當于每10 μl待測樣品含10-30μg蛋白，否則應增加細胞用量。

測定pNA標準曲線：

1. 用反應緩沖液稀釋10mM pNA標準品為200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125μM。設置不加pNA的零管。

2. 每一濃度取100 μl加入96孔板或100μl比色杯，測定405nm吸光度OD值。

3. 每一濃度標準管OD405值為x軸，對應的pNA濃度為y軸，用Excel制作pNA濃度對OD405值的標準曲線。

樣品測定操作：

1. 按下表設置96孔板反應體系。底物最后加入以使各管反應起始時間相同。設置不加樣品的空白對照管。酶活力不足或過高，可增加或減少樣品。

2. 蓋緊96孔板蓋子并用封口膜密封。37 oC反應2小時，肉眼可見顏色變黃時的OD405值約為0.2，此時即可測定。顏色變化不明顯可延長反應或過夜，但酶活性較強時，孵育時間過長將導致反應失去線性關系。

3. 樣品管OD405減去空白對照OD405，為樣品Caspase水解底物產生的pNA吸光度。根據標準曲線計算其含量，并以蛋白濃度校正之。

4. 測得的Caspase酶活性表示方法有兩種。(1) Caspase活性增加的百分比：100% × 實驗處理組OD / 實驗對照組OD，簡單而可靠。(2)樣品Caspase酶活力單位/mg protein，精確但計算較復雜，參見說明。